Metagenomics(元基因組學(xué)，或者宏基因組學(xué))，是由 Handelman等1998年最先提出的一種直接對(duì)微生物群體中包含的全部基因組信息進(jìn)行研究的手段。宏基因組測(cè)序是對(duì)特定環(huán)境樣品中的微生物群落基因組進(jìn)行高通量測(cè)序,以分析微生物群體基因組成多樣性與豐度,探求微生物與環(huán)境以及宿主之間的關(guān)系,發(fā)掘和研究新的、具有特定功能的基因。它規(guī)避了對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)的過(guò)程，提供了一種對(duì)不可分離培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究的途徑，更真實(shí)的反應(yīng)樣本中微生物組成、互作情況、系統(tǒng)進(jìn)化等，同時(shí)在分子水平對(duì)其代謝通路、基因功能進(jìn)行研究。
應(yīng)用方向
1. 健康和疾病人群細(xì)菌分類(lèi)鑒定、屬菌豐度統(tǒng)計(jì)、差異菌群Biomarker 篩選
2. 挖掘健康和疾病人群微生物群落中的功能基因等作為Biomarker
3. 疾病與微生物菌群、菌落中的功能基因關(guān)系的研究
實(shí)驗(yàn)方案
測(cè)序平臺(tái)與方式：Illumina平臺(tái) PE150
數(shù)據(jù)量：大于6G clean data
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 單次測(cè)序產(chǎn)生至少6G數(shù)據(jù)量,有利于發(fā)現(xiàn)特異物種信息,深度挖掘基因資源；
2. 無(wú)需分離培養(yǎng)微生物,對(duì)微生物群落多樣性和功能基因等宏觀特征進(jìn)行研究,能更有效、準(zhǔn)確的反應(yīng)出微生物的真實(shí)狀態(tài)；
3. 相較于16S rDNA測(cè)序，宏基因組不僅可以對(duì)細(xì)菌分類(lèi)進(jìn)行分析，還能進(jìn)行基因和功能層面的深入研究；
4. 16S rDNA測(cè)序一般注釋到屬水平，而宏基因組能鑒定到種水平甚至菌株水平，并且16S測(cè)序只擴(kuò)增了高變區(qū)的片段，宏基因組是將微生物基因組打斷并拼接組裝成較長(zhǎng)的序列，可以發(fā)現(xiàn)更多低豐度物種信息,構(gòu)建不同物種之間的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，因此在鑒定物種過(guò)程中具有更高的優(yōu)勢(shì)；
技術(shù)流程
圖1 宏基因組測(cè)序實(shí)驗(yàn)流程
數(shù)據(jù)分析
3.1數(shù)據(jù)質(zhì)控
3.2 Metagenome組裝
3.3 基因預(yù)測(cè)
3.4 物種注釋
3.5 功能注釋
3.6物種和功能分析
3.7抗性基因分析:獲得抗性基因豐度分布情況以及這些抗性基因的物種歸屬和抗性機(jī)制
3.8其他高級(jí)分析:如CCA/RDA分析,腸型分析,拷貝數(shù)變異(CNV)分析,CAG/MLG分析,病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)(PHI)注釋,分泌蛋白預(yù)測(cè), Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白預(yù)測(cè),細(xì)菌致病菌毒力因子(VFDB)注釋,轉(zhuǎn)移元件分析(MGE)等;同時(shí),結(jié)合環(huán)境因子、病理指標(biāo)或特殊表型進(jìn)行深入關(guān)聯(lián)研究,能夠?yàn)檫M(jìn)一步深入研究和利用樣品的物種和功能提供理論依據(jù)。
送樣建議
樣本來(lái)源：人、大鼠和小鼠（其它樣本類(lèi)型請(qǐng)咨詢(xún)）
人糞便樣本：>2g/樣；動(dòng)物糞便＞0.5g/樣
腸道內(nèi)容物樣本：200mg/樣
腸道組織樣本：>1g/樣品，塊狀物需要黃豆樣大小 1~2 粒/樣
運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)送
結(jié)果展示
圖2 各樣品Phylum水平的物種相對(duì)豐度柱形圖
圖3 各組Phylum水平的物種相對(duì)豐度柱形圖
（從不同分類(lèi)層級(jí)的相對(duì)豐度表出發(fā)，并將豐度 < 0.5% 的物種設(shè)置為 Others，繪制出各樣品對(duì)應(yīng)的物種注釋結(jié)果在不同分類(lèi)層級(jí)上的相對(duì)豐度柱形圖）
圖4 各樣品Phylum水平的物種相對(duì)豐度熱圖
圖5 各組Phylum水平的物種相對(duì)豐度熱圖
（從不同分類(lèi)層級(jí)的相對(duì)豐度表出發(fā)，每個(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從物種層面進(jìn)行聚類(lèi)，便于結(jié)果展示和信息發(fā)現(xiàn)，從而找出樣品中聚集較多的物種）
圖6 基于LDA score篩選的biomarker
圖7 特征物種的柱狀環(huán)形圖
圖8 KEGG注釋基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖
案例分析 ：利用宏基因組新一代測(cè)序技術(shù)洞察肺結(jié)核患者獨(dú)特的肺菌群圖譜
Insights into the Unique Lung Microbiota Profile of Pulmonary Tuberculosis Patients Using Metagenomic Next-Generation Sequencing[1]
研究方案：為探究與肺結(jié)核相關(guān)的微生物群分布情況，并研究抗結(jié)核治療期間的縱向變化，研究者采集8 名健康人(HCG)、12 名未治療的肺結(jié)核患者(UTG)、15 名已治療的肺結(jié)核患者(TTG)、11 名治愈的肺結(jié)核患者(CTG)和 7 名肺癌患者（LCG）的支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本，并在健康對(duì)照組中采集咽拭子。利用metagenomic sequencing分析比較指定組中微生物群的差異，對(duì)結(jié)核病患者的肺部微生物群進(jìn)行了表征，并評(píng)估抗結(jié)核治療對(duì)肺微生物群的影響。
研究結(jié)果：本研究對(duì)所有隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)行了主坐標(biāo)（CAP）分析，發(fā)現(xiàn)在屬和種水平上，咽拭子和 BALF 樣本之間的微生物群組成存在明顯分離。為了研究上呼吸道和下呼吸道微生物群的差異，研究者比較了健康對(duì)照的咽拭子和 BALF 間的微生物群，發(fā)現(xiàn)咽拭子中的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在種和屬水平上均遠(yuǎn)高于BALF，香農(nóng)指數(shù)在種水平上顯著高于BALF，但在屬水平上無(wú)顯著差異，而辛普森指數(shù)在種或?qū)偎缴线@兩組樣本之間沒(méi)有顯著差異。主坐標(biāo)分析 (PCoA) 顯示，在種和屬水平上，BALF 簇與咽拭子簇明顯分離，表明上呼吸道和下呼吸道之間的微生物群組成不同。進(jìn)一步研究者分析了咽拭子和 BALF 間相對(duì)豐度top 30的物種，發(fā)現(xiàn)咽拭子和BALF中top30的細(xì)菌分別占細(xì)菌總數(shù)的61.58%和84.03%，其中，Klebsiella pneumoniae、Staphylococcus aureus、Pasteurella multocida是三組中的優(yōu)勢(shì)物種。為了研究長(zhǎng)期抗結(jié)核治療后治愈的結(jié)核病患者的肺微生物群的變化機(jī)制，研究者比較了HCG和CTG之間的微生物組成，發(fā)現(xiàn)2組的多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著差異，通過(guò)LEfSe分析（LDA SCORE>2.0）也并未發(fā)現(xiàn)兩組之間有存在差異的物種，結(jié)果表明治愈的結(jié)核病患者表現(xiàn)出與健康人相似的肺微生物群結(jié)構(gòu)和組成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTG比HCG顯示出更多的多樣性和豐富的ARGs，并在 cooccurrence network中顯示CTG中細(xì)菌和ARGs的連接要比HCG中的復(fù)雜。結(jié)果表明，肺結(jié)核患者區(qū)別于健康個(gè)體和肺癌患者表現(xiàn)出獨(dú)特的微生物組成，抗結(jié)核病治療增加了肺微生物群的α多樣性并影響了β多樣性，加速了ARGs的富集。通過(guò)對(duì)肺部微生物群進(jìn)行分析比較有助于更好地了解肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制。
圖9 所有樣本中的菌群情況
圖10 來(lái)自健康對(duì)照組的咽拭子和BALF樣本之間的菌群分布有顯著差異
參考文獻(xiàn)：Xiao G, Cai Z, Guo Q, et al. Insights into the Unique Lung Microbiota Profile of Pulmonary Tuberculosis Patients Using Metagenomic Next-Generation Sequencing[J]. Microbiology spectrum, 2022, 10(1): e01901-21.
