16S rDNA測(cè)序是細(xì)菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對(duì)應(yīng)的DNA序列，序列全長(zhǎng)約1540bp，由10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)可變區(qū)（V1-V9）組成。保守區(qū)序列在細(xì)菌間差異不大而高變區(qū)則具有種屬特異性，因此最常用作細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)提取環(huán)境樣品DNA，擴(kuò)增其中16S rDNA基因（常見(jiàn)擴(kuò)增區(qū)域：V×4區(qū)、V3-V4區(qū)、V4-V5區(qū)），對(duì)片段進(jìn)行高通量測(cè)序并與細(xì)菌注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而完成對(duì)樣品細(xì)菌種類、豐度、差異菌群和系統(tǒng)進(jìn)化等諸多信息分析。這對(duì)于研究微生物菌群和疾病之間的發(fā)病機(jī)制等方面發(fā)揮著重要的作用。
應(yīng)用方向
1. 健康和疾病人群細(xì)菌分類鑒定、屬菌豐度統(tǒng)計(jì)、差異菌群Biomarker 篩選
2. 疾病與微生物菌群之間發(fā)病機(jī)制的研究；
實(shí)驗(yàn)方案
測(cè)序策略: Illumina NovaSeq 6000，PE250
數(shù)據(jù)量:每個(gè)樣>5萬(wàn)條raw reads
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 與微生物傳統(tǒng)鑒定方法相比，16S rDNA測(cè)序可以鑒定出許多不能純化培養(yǎng)的新菌種，方法簡(jiǎn)便快捷、精確度高、重復(fù)性更好；
2. 測(cè)序數(shù)據(jù)量少，具有較低的成本，性價(jià)比較高；
3. 可以針對(duì)一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)進(jìn)行序列讀取，能更準(zhǔn)確的進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定；
4. 可以鑒定出低豐度細(xì)菌，靈敏度更高；
技術(shù)流程
圖1 16S rDNA測(cè)序實(shí)驗(yàn)流程
數(shù)據(jù)分析
(1)按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估;
(2) Tags拼接、過(guò)濾;
(3)物種組成分析(與RDP,Silva,GreenGene等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)) ;
(4) OTU統(tǒng)計(jì)及venn圖分析;
(5) OTU Rank曲線;
(6)物種積累曲線;
(7)物種注釋及其豐度分析(柱狀圖和熱圖分析)
(8)物種系統(tǒng)進(jìn)化分析;
(9)單個(gè)樣本復(fù)雜度分析(α多樣性分析);
(10)樣本間/組間α多樣性差異統(tǒng)計(jì)分析及盒形圖;
(11)樣品間復(fù)雜度分析: β多樣性heatmap分析;
(12) β多樣性PCoA分析(2D/3D);
(13) NMDS-2D/3D分析；
(14)樣本組間差異分析: Adonis分析,相似性分析,RDA/CCA分析等;
(15)不同樣本間物種組成聚類分析(樣品數(shù)>=3)
(16)其他高級(jí)分析:比如PICRUSt預(yù)測(cè)宏基因組的功能組成。
送樣建議
樣本來(lái)源：人、大鼠和小鼠（其它樣本類型請(qǐng)咨詢）
糞便樣本>2g/樣
腸道內(nèi)容物>100μL/樣
運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)送
結(jié)果展示
圖2 Control-vs-Teatment OTU Venn圖
（在在97%的相似度下，得到了每個(gè)樣品的OTU數(shù)，利用Venn圖可以展示多樣品共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。圖中不同顏色圖形代表不同樣品或者不同組別，不同顏色圖形之間交疊部分?jǐn)?shù)字為兩個(gè)樣品或兩個(gè)組別之間共有的OTU個(gè)數(shù)。）
圖3 樣本Phylum 水平物種豐度組成
圖4 組間Phylum 水平物種豐度組成
圖5 樣本Phylum水平物種豐度熱圖
圖6 組間Phylum水平物種豐度熱圖
圖7 組間Alpha多樣性盒形圖
（組間Alpha多樣性盒形圖，更直觀顯示組間Alpha多樣性差異。盒形圖可以顯示5個(gè)統(tǒng)計(jì)量（最小值，第一個(gè)四分位數(shù)，中位數(shù)，第三個(gè)中位數(shù)和最大值，及由下到上的5條線），異常值以“o”標(biāo)。）
圖8 基于LDAscore篩選的biomarker
圖9 特征物種的柱狀環(huán)形圖
案例分析 ：利用16S rDNA 測(cè)序?qū)?fù)發(fā)性膽總管結(jié)石進(jìn)行微生物群分析
Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[1].
研究方案：內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影術(shù)（ERCP）是膽結(jié)石的主要治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率很高。最近研究表明膽道微生物群參與膽石癥的發(fā)病機(jī)制。然而膽道微生物群失調(diào)與復(fù)發(fā)性膽石癥相關(guān)性機(jī)制尚未得到研究；本課題通過(guò)收集5例復(fù)發(fā)性（CBD）結(jié)石（FF）患者和45例原發(fā)性CBD結(jié)石（YF）患者的膽汁標(biāo)本進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序。
研究結(jié)果：在門(mén)水平上，變形菌門(mén)（proteobacteria）和厚壁菌門(mén)（firmicutes）是主要的菌屬，FF患者的變形菌門(mén)（proteobacteria）含量比較高。此外，FF患者的擬桿菌（Bacteroidetes）和放線菌（actinobacteria）含量低。YF患者膽汁中的微生物菌群比FF患者膽汁中的分布更均勻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FF患者膽汁微生物多樣性降低。在屬水平上，克雷伯氏菌（klebsiella）在FF患者中占主導(dǎo)地位，而埃希氏志賀氏菌（Escherichia-shigella）在YF患者中占主導(dǎo)地位。此外，F(xiàn)F患者中的克雷伯氏菌高于YF患者。本研究發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)性CBD結(jié)石FF患者和YF患者之間的微生物菌群在屬水平上的差異，這為膽道微生物群變化與復(fù)發(fā)性CBD結(jié)石之間的關(guān)系提供了新的見(jiàn)解。
圖10. YF和FF患者膽汁中微生物菌群的多樣性分析
參考文獻(xiàn)：Tan W, Chen R, Song J, et al. Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[J]. Annals of Translational Medicine, 2022, 10(10).
