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免疫共沉淀 【技術(shù)簡(jiǎn)介】 （1）技術(shù)原理 免疫共沉淀：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 （2）技術(shù)應(yīng)用 篩選調(diào)控蛋白在基因組上的結(jié)合靶點(diǎn)：針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、DNA/RNA 聚合酶、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等調(diào)控因子蛋白進(jìn)行特異性的富集，分離純化與之結(jié)合的靶 DNA 片段并測(cè)序，分析篩選到準(zhǔn)確有效的靶位點(diǎn)、靶基因數(shù)據(jù)；揭示差異化表觀遺傳變異的原理：通過(guò)對(duì)不同表型組織內(nèi)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子蛋白及其他結(jié)合蛋白進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序并定量分析靶基因表達(dá)調(diào)控水平或針對(duì)同種組蛋白進(jìn)行甲基化、磷酸化、泛素化修飾所導(dǎo)致的結(jié)合位點(diǎn)變異進(jìn)行分析，即可準(zhǔn)確揭示差異化表觀變異原理；研究表觀遺傳變異疾病：借助染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息分析揭示由蛋白與 DNA 相互作用變異而引起的疾病的原理，明確表觀遺傳修飾在癌癥等表觀遺傳變異疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制。 【服務(wù)內(nèi)容】 蛋白質(zhì)抽取與定量；SDS-PAGE分離Co-IP產(chǎn)物；Co-IP實(shí)驗(yàn)（以normal lgG作為對(duì)照）；western blot或質(zhì)譜鑒定。 【客戶須知及標(biāo)本要求】 （1）客戶須明確檢測(cè)目的和具體要求，最好能提供1~2篇文獻(xiàn)或資料。 （2）客戶需提供待檢測(cè)樣品、免疫沉淀用抗體和WB檢測(cè)用抗體（抗體也可由我們代購(gòu)）； （3）待檢測(cè)樣品可以是直接的待檢測(cè)蛋白樣品，也可以是細(xì)胞、組織或細(xì)菌樣品，但需收取蛋白抽提費(fèi)用。樣本收集后應(yīng)立-80℃保存； （4）免疫沉淀盡量提供未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。
MeDIP-Seq DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、傳遞基因組印記、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控胚胎發(fā)育以及腫瘤等疾病發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，MeDIP-Seq）通過(guò)5’-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，然后將富集后的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。該技術(shù)不受物種和基因組區(qū)域的限制，是全面且深入理解表觀遺傳調(diào)控的重要工具。通過(guò)MeDIP-Seq快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。 1、 實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數(shù)據(jù)量：推薦20M clean data 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率； （2）重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性好，適用于多樣本間的差異分析； （3）檢測(cè)范圍廣：覆蓋全基因組范圍內(nèi)超過(guò)百萬(wàn)級(jí)CpG位點(diǎn)個(gè)數(shù)； （4）高性價(jià)比：相比于WGBS，采用MeDIP-Seq通過(guò)抗體富集高甲基化區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，有效降低測(cè)序費(fèi)用。 3、數(shù)據(jù)分析 3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析 （1）MeDIP-Seq序列與參考序列比對(duì)； （2）統(tǒng)計(jì)reads在全基因組的分布情況； （3）統(tǒng)計(jì)reads在CpG區(qū)域的分布情況； （4）統(tǒng)計(jì)reads在不同功能元件區(qū)域（Promoter，UTR，Exon，Intron）的分布情況； （5）統(tǒng)計(jì)reads在不同GC含量區(qū)域中的分布情況； （6）統(tǒng)計(jì)序列富集區(qū)域（peak）； （7）統(tǒng)計(jì)與peak相關(guān)的基因； （8）統(tǒng)計(jì)peak在不同功能元件區(qū)域（Promoter，UTR，Exon，Intron）的分布情況； （9）多樣本peak差異分析及差異peak相關(guān)基因注釋、GO分類和pathway顯著性富集分析； 3.2 高級(jí)信息分析 （1）與表達(dá)譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，預(yù)測(cè)甲基化調(diào)控基因（需有表達(dá)譜數(shù)據(jù)）； （2）MeDIP-Seq數(shù)據(jù)可視化分析：生成Genome Browser可以導(dǎo)入的文件。 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）可塑性基因的DNA甲基化變化伴隨著記憶的塑造和維持 形成記憶的能力是一個(gè)有機(jī)體的行為適應(yīng)環(huán)境變化的先決條件。在分子水平上，記憶的獲得和保持需要在染色質(zhì)方面修飾。為了解開(kāi)表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)下的短期和長(zhǎng)期記憶，德國(guó)退行性神經(jīng)疾病研究中心（DZNE）小組成員研究了在兩個(gè)截然不同的老鼠大腦區(qū)域...
全基因組甲基化測(cè)序 甲基化是基因表達(dá)的主要調(diào)控方式之一，它在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記，胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用，更是表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。 全基因組甲基化測(cè)序是將重亞硫酸鹽處理和Illumina HiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)相結(jié)合，能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜。用標(biāo)準(zhǔn)bisμlfite方法處理DNA后，未甲基化的胞嘧啶C會(huì)脫氨基形成尿嘧啶U。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，尿嘧啶U替換為胸腺嘧啶T，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶C保持不變。通過(guò)Bisulfite處理序列與參考序列的比對(duì)，可對(duì)全基因組甲基化情況進(jìn)行定量分析。 全基因組甲基化測(cè)序可用于研究物種特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步研究環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)以及其他因素對(duì)特定基因甲基化的影響，為人類疾病的發(fā)生、治療，以及動(dòng)植物分子育種等提供研究基礎(chǔ)。 1、實(shí)驗(yàn)方案 平臺(tái)：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 數(shù)據(jù)量：推薦測(cè)序深度30~50× （所測(cè)物種須有全基因組參考序列） 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）高效快速：借助高通量測(cè)序平臺(tái)可以快速檢測(cè)出全基因組的甲基化情況； （2）性價(jià)比高：相對(duì)于傳統(tǒng)的 PCR+Sanger測(cè)序方法，費(fèi)用少； （3）檢測(cè)精度高：?jiǎn)螇A基分辨率，精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。 3、數(shù)據(jù)分析 3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析 （1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估； （2）Bisulfite測(cè)序序列與參考基因組比對(duì)； （3）甲基化位點(diǎn)檢測(cè)； （4）全基因組甲基化水平統(tǒng)計(jì)：CG、CHG、CHH的甲基化水平； （5）染色體水平甲基化分布統(tǒng)計(jì)； （6）不同基因組功能元件甲基化分布統(tǒng)計(jì)； （7）CpG、CHG 和CHH 甲基化比例統(tǒng)計(jì)； （8）差異性甲基化區(qū)域分析（DMR）； （9）全基因組甲基化圖譜繪制。 3.2 高級(jí)信息分析 根據(jù)客戶具體研究進(jìn)行的個(gè)性化分析。 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）人類早期胚胎全基因組水平的DNA甲基化圖譜的繪制 來(lái)自北京大學(xué)、哈佛大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員采用全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序法（whole-genome bisulfite sequencing），對(duì)從合子期到植入后的人類早期胚胎甲基化組進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究人員證實(shí)，不同于以往在小鼠研究中觀察的結(jié)果，主要一波全基因組去甲基化是在2-細(xì)胞期完成。并且父方...
RRBS Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過(guò)MspI酶識(shí)別CCGG酶切位點(diǎn)處理DNA，富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行 Bisulfite處理和高通量測(cè)序，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點(diǎn)，與基因表達(dá)、表型性狀息息相關(guān)。 RRBS作為一種高性價(jià)比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150 數(shù)據(jù)量：推薦5G clean data 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率，見(jiàn)下表； （2）重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性高達(dá)85%-95%，適合多樣本間的甲基化差異分析； （3）檢測(cè)范圍廣： 覆蓋全基因組范圍內(nèi)超過(guò)5百萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)； （4）性價(jià)比高：測(cè)序區(qū)域更有針對(duì)性，數(shù)據(jù)利用率更高。 表1 三種甲基化研究技術(shù)比較 甲基化研究方法 Bisulfite-Seq RRBS MeDIP-Seq 覆蓋范圍 全基因組 主要集中在CpG島和promoter區(qū)域 全基因組范圍，但是傾向于高CpG密度和高甲基化區(qū)域 原理 Bisulfite處理 酶切+Bisulfite處理 抗體富集 分辨率 1bp 1bp 100-1000bp 數(shù)據(jù)量 ≥30X 基因組 3G、5G 4G 鑒定MDR的數(shù)量 多 多 少 ...
CLIP-Seq CLIP- Seq，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序（crosslinking-immunoprecipitation and high-throughput sequencing），是一項(xiàng)在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。 主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，再對(duì)這些分子進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的分析，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對(duì)生命的意義。 最近幾年，這項(xiàng)技術(shù)也被應(yīng)用到miRNA靶標(biāo)鑒定等工作中。在動(dòng)物體內(nèi)，成熟的單鏈miRNA與一系列蛋白形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），結(jié)合于靶mRNA的3"-UTR 區(qū)，阻止所結(jié)合的mRNA的翻譯或直接降解靶miRNA?；谶@一原理，我們可以通過(guò)CLIPSeq技術(shù)來(lái)進(jìn)行mRNA靶基因的篩選。CLIP-Seq方法的應(yīng)用能夠非常明顯地降低miRNA結(jié)合位點(diǎn)的假陽(yáng)性預(yù)測(cè)頻率，并且減小miRNA結(jié)合位點(diǎn)搜尋空間的范圍，可以在全基因組范圍內(nèi)鑒定AGO2蛋白在不同RNA上的結(jié)合位點(diǎn)。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數(shù)據(jù)量：20M clean reads 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）全轉(zhuǎn)錄組覆蓋：與CLIP芯片相比，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行篩選與鑒定； （2）高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數(shù)百萬(wàn)條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究轉(zhuǎn)錄組上稀有的蛋白結(jié)合位點(diǎn)； （3）準(zhǔn)確性高： 從活細(xì)胞交聯(lián)開(kāi)始，反應(yīng)了體內(nèi)環(huán)境下真實(shí)的分子間相互作用； （4）特異性強(qiáng)： 紫外輻射不會(huì)造成蛋白和蛋白之間的交聯(lián)，只會(huì)鑒定出蛋白和 RNA 之間的相互作用； （4）應(yīng)用范圍廣： 特別適用于研究剪接因子RNA結(jié)合圖譜、miRNA作用靶點(diǎn)等研究。 3、數(shù)據(jù)分析 （1）將reads比對(duì)到基因組：將預(yù)處理reads與reference genome進(jìn)行mapping，最后得到mapping的sam結(jié)果文件，給出mapping結(jié)果統(tǒng)計(jì)； （2）peak detect：應(yīng)用sam文件進(jìn)行peak富集區(qū)查找； （3）motif detect：查找結(jié)合位點(diǎn)區(qū)結(jié)構(gòu)特性，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的motif結(jié)構(gòu)； （4）基因關(guān)聯(lián)：應(yīng)用結(jié)合位點(diǎn)區(qū)位置，確定其周圍所涉及的基因； （5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對(duì)結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析。 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）依賴SIRT7去乙?；腢3-55K蛋...
RIP-Seq RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能更有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。RIP-seq技術(shù)使用特異性抗體對(duì)RNA結(jié)合蛋白或者特殊修飾的RNA進(jìn)行免疫共沉淀后，分離純化RNA，通過(guò)高通量測(cè)序和分析，深度解析與目標(biāo)蛋白相互結(jié)合的RNA的區(qū)域或種類。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數(shù)據(jù)量：20M clean reads 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）全轉(zhuǎn)錄組覆蓋：與RIP芯片相比，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行篩選與鑒定； （2）高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數(shù)百萬(wàn)條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究轉(zhuǎn)錄組上稀有的蛋白結(jié)合位點(diǎn)； （3）高精確率：可獲得高水平的信噪比數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確區(qū)分真實(shí)事件與噪音，精確定位蛋白結(jié)合位點(diǎn)； （4）重復(fù)性好：深度測(cè)序保證了檢測(cè)隨機(jī)性，可不需技術(shù)重復(fù)。 3、數(shù)據(jù)分析 3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析 （1）將reads比對(duì)到基因組：將預(yù)處理reads與reference genome進(jìn)行mapping，最后得到mapping的sam結(jié)果文件，給出mapping結(jié)果統(tǒng)計(jì)； （2）peak detect：應(yīng)用sam文件進(jìn)行peak富集區(qū)查找； （3）motif detect：查找結(jié)合位點(diǎn)區(qū)結(jié)構(gòu)特性，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的motif結(jié)構(gòu)； （4）基因關(guān)聯(lián)：應(yīng)用結(jié)合位點(diǎn)區(qū)位置，確定其周圍所涉及的基因； （5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對(duì)結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析。 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A運(yùn)輸?shù)叫蛄羞x擇性翻譯抑制物 Rocaglamide A（RocA）代表一類能夠選擇性殺傷非整倍體腫瘤細(xì)胞和抑制特殊mRNA翻譯的蛋白合成抑制劑。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一種ATP依賴性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA選擇性是作用于高度結(jié)構(gòu)化的5’非翻譯區(qū)，這一過(guò)程高度依賴于eIF4A-調(diào)節(jié)的解旋反應(yīng)。然而，美國(guó)加州大學(xué)分子與細(xì)胞生物學(xué)系研究人員利用Rip-seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Rocaglate（藥物）治療也許并不能從表現(xiàn)形式上復(fù)制eIF4A活性的缺失導(dǎo)致的缺陷，因?yàn)檫@藥物實(shí)際上只是增加了eIF4A和RNA的親和力。特別說(shuō)明的是5’非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于RocA選擇性而言只是一個(gè)次要的決定因素，同時(shí)該RocA不會(huì)通過(guò)降低eIF4A有效性來(lái)抑制翻譯。相反，在體外和細(xì)胞中，RocA以ATP非依賴性的方式特異性地將eIF4A夾送到...
ChIP-Seq 染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是在體內(nèi)環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾、特定轉(zhuǎn)錄因子的基因調(diào)控作用等相關(guān)領(lǐng)域。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)與高通量測(cè)序的整合——ChIP-seq，可在全基因組范圍對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，同時(shí)也為研究的深入開(kāi)展打下基礎(chǔ)。 采用特異性抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀后，分離與其結(jié)合的基因組DNA片段，再通過(guò)高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析，在全基因組范圍內(nèi)尋找目的蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)，并且可以基于多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數(shù)據(jù)量：20M clean reads 2、數(shù)據(jù)分析 2.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析 （1）與參考序列比對(duì) （2）Peak分析 （3）Peak在基因功能元件上的分布 （4）Peak相關(guān)基因分析 （5）Peak相關(guān)基因的GO功能顯著性富集分析 （6）Peak相關(guān)基因的Pathway功能顯著性富集分析 （7）鑒定樣品間差異Peak （8）樣品間差異Peak的基因功能元件分布 （9）樣品間差異Peak相關(guān)基因分析 （10）樣品間差異Peak相關(guān)基因的GO功能顯著性富集分析 （11）樣品間差異Peak相關(guān)基因的Pathway功能顯著性富集分析 （12）motif結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 3、技術(shù)流程 4、案例分析 案例（1）FOXO轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)特征 FOXO轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）是控制物種壽命的中心調(diào)控因子，但是FOXO執(zhí)行特定的細(xì)胞功能，包括成人干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)和免疫功能。FOXO直接作用的靶點(diǎn)已經(jīng)在若干物種和細(xì)胞類型中鑒定得到。用meta分析從組織到生物體，以及哺乳動(dòng)物，秀麗線蟲和果蠅的FOXO靶向位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，F(xiàn)OXO作用的特定細(xì)胞是與細(xì)胞特定功能的相關(guān)的。而且FOXO在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中存在相同保守區(qū)域的作用位點(diǎn)。這些與生物生長(zhǎng)，新陳代謝，抗壓力，蛋白質(zhì)平衡相關(guān)的保守區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)表明，這些生物可能擁有同一個(gè)祖先。 圖1 FOXO轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合組織特異性的共同靶點(diǎn) 圖2 FOXO轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶點(diǎn)維恩圖和保守性分析 案例（2） 肝受體X和PPARG在癌細(xì)胞增殖不同調(diào)控機(jī)制的定義 肝受體X（LXRs，NR1H2，NR1H3）和P...
CircRNA測(cè)序 環(huán)狀RNA（circular RNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是mRNA在剪接的過(guò)程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀分子。 研究發(fā)現(xiàn)，高等動(dòng)物中環(huán)狀RNA的種類和含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)預(yù)期。circRNA具有很多重要的調(diào)控功能，如circRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jié)合胞內(nèi)miRNA，阻斷miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調(diào)控其他類型RNA、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達(dá)特異性，且circRNA對(duì)RNase不敏感，因此它比線性RNA更為穩(wěn)定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE 150 數(shù)據(jù)量：推薦8-12G clean data 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）多物種選擇：可直接對(duì)人、大鼠和小鼠樣本進(jìn)行最全面的circRNA分析，亦可發(fā)現(xiàn)新的circRNA（其他物種需特殊評(píng)估）； （2）高精確度：數(shù)字化信號(hào)，可預(yù)測(cè)到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類型產(chǎn)生的circRNA序列信息； （3）高覆蓋度：新一代高通量測(cè)序技術(shù)的高深度覆蓋，可以檢測(cè)到低豐度的稀有circRNA。 3、數(shù)據(jù)分析 3.1標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析 （1）參考序列比對(duì)分析 （2）circRNA鑒定 （3）circRNA 來(lái)源基因分析 （4）circRNA表達(dá)水平分析 （5）樣本之間差異表達(dá)的circRNA （6）差異circRNA篩選 （7）差異circRNA聚類分析 （8）差異circRNA來(lái)源基因GO富集分析 （9）差異circRNA來(lái)源基因KEGG富集分析 （10）miRNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）環(huán)狀RNA促進(jìn)結(jié)腸癌增殖和轉(zhuǎn)移 研究者對(duì)正常組織和腫瘤結(jié)腸組織樣本進(jìn)行了circRNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量在腫瘤細(xì)胞中特異性升高的circRNA，其中一些circRNA得到了RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。研究人員對(duì)其中一類新的circRNA——circCCDC66的功能進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明circCCDC66在息肉和結(jié)腸癌中表達(dá)水平升高，并且與不良預(yù)后相關(guān)。通過(guò)在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行功能獲得性研究和功能缺失性研究，研究人員證明circCCDC66能夠控制多個(gè)生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和...
小RNA測(cè)序 小RNA是一類高度保守的小RNA分子，它可以參與基因表達(dá)與調(diào)控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等重要生物學(xué)過(guò)程，是生命活動(dòng)中必不可少的調(diào)控因子。小RNA測(cè)序技術(shù)采用膠分離技術(shù)，收集樣本中18-30nt的RNA片段，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中所有small RNA家族進(jìn)行測(cè)序和表達(dá)定量，從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列，并預(yù)測(cè)新的小RNA及其靶基因。 1、實(shí)驗(yàn)方案 測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500 SE50 數(shù)據(jù)量：推薦10M clean reads 2、技術(shù)優(yōu)勢(shì) （1）通量高：一次測(cè)序得到上千萬(wàn)條序列； （2）分辨率高：可以檢測(cè)小RNA單個(gè)堿基的差異； （3）精準(zhǔn)度高：從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計(jì)數(shù)； （4）可重復(fù)性好：深度測(cè)序保證了抽樣隨機(jī)性，重復(fù)性好，無(wú)需重復(fù)實(shí)驗(yàn)； （5）檢測(cè)范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現(xiàn)新的小RNA。 3、信息分析 3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析 （1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估； （2）樣品間的公共序列和特異序列分析； （3）小RNA與參考基因組比對(duì)分析； （4）按照優(yōu)先級(jí)將小RNA進(jìn)行分類注釋 （5）Novel Small RNA預(yù)測(cè)； （6）樣本間miRNA差異表達(dá)分析； （7）已知miRNA的家族分析； （8）已知miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）； （9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預(yù)測(cè)； （10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析； （11）novel miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）； （12）差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)； （13）已知miRNA的堿基編輯分析； 3.2 高級(jí)信息分析 （1）snoRNA注釋 （2）piRNA注釋 （3）mir2disease注釋 4、技術(shù)流程 5、案例分析 案例（1）小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能 該研究利用優(yōu)化的方法系統(tǒng)解析了小鼠卵子到受精后8細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類小RNA絕大多數(shù)來(lái)源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩...
